|
Рентгеновские лучи выявили неожиданную функцию белков
|
|
|
|
Группа ученых из Корнеллского университета и Брукхейвенской национальной лаборатории Министерства энергетики США (DOE) выявила неожиданную функцию транспортного белка и его роль в регуляторных механизмах растений. Их исследование, опубликованное в журнале The Plant Cell ранее в этом году, может помочь уменьшить дефицит минеральных веществ у человека путем упаковки необходимых микроэлементов в съедобные части растений. Железо является важным минералом для человека. Помимо того, что железо является ключевым компонентом гемоглобина (белка эритроцитов, который переносит кислород по всему организму), оно помогает иммунной системе и играет роль в когнитивных функциях. Организм человека не может вырабатывать железо, поэтому его необходимо регулярно употреблять. Растения, такие как шпинат, являются одним из источников железа, но их строгие механизмы регулирования предотвращают чрезмерное накопление минералов, поскольку в высоких концентрациях они токсичны для растений. Однако ученые изучают транспорт минералов, таких как железо, чтобы найти способ обойти эти регуляторные механизмы и повысить пищевую ценность съедобных растений.
|
|
|
|
«Эта история началась давно», — объяснила Елена Ватаманюк, биолог растений из Корнелла и руководитель лаборатории, ответственной за это исследование. Почти десять лет назад Ватаманюк и ее коллеги опубликовали удивительное открытие: транспортный белок под названием олигопептид-переносчик 3 (OPT3) отвечает за перемещение железа внутри модельного растения Arabidopsis thaliana, а не олигопептиды (маленькие пептиды), которым этот транспортер был назван. В рамках более раннего исследования исследователи из Университета Миссури обнаружили, что снижение OPT3 изменило распределение железа по растению A. thaliana; корни демонстрировали признаки дефицита железа, несмотря на обилие железа в листьях. Это указывало на то, что роль OPT3 была связана с передачей статуса железа от листьев, известных как побеги, к корням.
|
|
|
Эти два открытия были лишь началом сложной истории. «В нашем последнем исследовании мы хотели использовать наши знания о роли OPT3, чтобы выяснить, как транспортер связан с передачей сигналов от отростка к корню», — сказал Ватаманюк. Заглянуть внутрь растений с помощью сверхярких рентгеновских лучей было первым шагом, но OPT3 приготовил еще один сюрприз для ученых. Когда ученые хотят выяснить, что делает белок, они часто предпочитают наблюдать, чего не происходит, когда большая часть белка, если не вся, удаляется из образца. Удаление всего белка OPT3 было бы смертельным для видов растений, использованных в этом исследовании, поэтому исследователи генетически изменили растения, создав «мутанты» с меньшим количеством транспортеров OPT3. Ватаманюк и ее коллеги хотели посмотреть, как различается распределение железа по сосудистой системе у мутантных и неизмененных растений. Исследователи были особенно заинтересованы в транспортной ткани, называемой флоэмой, поскольку почти десять лет назад они обнаружили, что OPT3 переносит железо в эту ткань. Флоэма обычно переносит питательные вещества из областей, где они высоко концентрированы (так называемых источников), в области, где их мало (так называемых поглотителей). Это контрастирует с сосудистой тканью ксилемы, которая переносит воду и питательные вещества от корней к побегам.
|
|
|
|
Одним из способов анализа распределения железа в тканях и клетках является конфокальная рентгеновская флуоресцентная визуализация (C-XRF), метод, недавно разработанный ученым из Корнелла Артуром Уоллом. Как и обычная рентгенофлуоресцентная визуализация (РФА), в этом методе используется яркий рентгеновский свет, чтобы выявить расположение различных химических элементов в образце. Но добавление очень маленькой специальной линзы, разработанной Уоллом, называемой конфокальной оптикой, обеспечивает исследователям чувствительность к глубине, позволяющую количественно определять концентрации элементов в определенных отсеках толстых образцов. Исследователи из Корнелла создают эти линзы с помощью процесса, называемого нанопроизводством. Чтобы применить эту технику в сверхмалых масштабах, ученые Корнелла поместили свой образец в один из самых совершенных источников рентгеновского света в мире — Национальный источник синхротронного света II (NSLS-II). NSLS-II — это пользовательское учреждение Управления науки Министерства энергетики США в Брукхейвенской лаборатории, которое излучает световые лучи, в 10 миллиардов раз ярче солнечных.
|
|
|
|
«NSLS-II была единственной установкой с достаточно ярким лучом, чтобы обеспечить нам желаемое разрешение», — объяснил Джу-Чен Чиа, исследователь лаборатории Ватаманюка и ведущий автор этой статьи. «В то время ни одно другое учреждение не могло предоставить нам необходимые нам изображения C-XRF с разрешением в один микрон». Первой остановкой исследовательской группы на NSLS-II стала линия рентгеновской спектроскопии субмикронного разрешения (SRX), которую возглавил Эндрю Кисс. Уолл и Кисс разместили серию зеркал, чтобы сфокусировать рентгеновский луч до размера одного квадратного микрона на участке черешка — части растения, соединяющей листья со стеблем. Взаимодействие между рентгеновским лучом и черешком листа испускало флуоресцентные рентгеновские сигналы, которые распространялись через наноизготовленную конфокальную оптику, расположенную всего в одном миллиметре, прежде чем они были зарегистрированы кремниевым дрейфовым детектором.
|
|
|
|
«Это было действительно сложно с технической точки зрения», — отметил Кисс. Помимо работы с небольшим размером пятна луча, исследователям также пришлось обеспечить сбор рентгеновских лучей только с поверхности черешка листа. Рентгеновские лучи, собранные из глубины образца, уменьшат разрешение и эффективно размоют изображение. Рентгеновская флуоресценция содержит характерные энергии, которые подобны отпечаткам пальцев для каждого элемента в образце. Кисс и ученые из Корнелла расшифровали эти рентгеновские снимки, чтобы выяснить, какие элементы находились в образце, их концентрацию и точное местонахождение. «В исходной статье мы предположили, что OPT3 важен для загрузки железа во флоэму», — объяснил Чиа. «Итак, мы подумали, что если мы проанализируем сосудистые ткани мутантного растения с помощью C-XRF, мы должны увидеть больше железа в ксилеме, но меньше железа во флоэме мутанта». Исследователи нашли именно то, что искали, но последующий анализ застал их врасплох.
|
|
|
|
Некоторые транспортные белки перемещают более одной молекулы; у растений железо часто переносится с цинком или марганцем. Таким образом, анализ распределения нескольких минералов, помимо интересующего минерала, является довольно распространенной практикой при проведении рентгенофлуоресцентных экспериментов. «Иногда изменение концентрации одного минерала вызывает ряд других изменений концентрации в растениях», — объяснил Чиа. «Железо, медь, цинк и марганец — важные минералы для роста растений, поэтому нам нравится рассматривать их все одновременно». Хотя это важно, медь обычно не имеет общих переносчиков с другими минералами в растениях. Вот почему исследователи были особенно шокированы, когда обнаружили изменения в распределении меди у мутантного растения, которые имитировали распределение железа у мутанта, что указывает на то, что OPT3 также переносит медь во флоэму. «Если бы мы не привезли наши образцы на NSLS-II, мы бы никогда не рассматривали возможность использования одного транспортера, перевозящего и железо, и медь на заводе», — сказал Ватаманюк, подчеркнув, насколько неожиданными были эти результаты. «Это довольно необычно».
|
|
|
|
«Эта работа стала большим техническим достижением для канала SRX», — отметил Кисс. «Но это была еще большая демонстрация опыта и сотрудничества здесь, на NSLS-II». На протяжении всех этих экспериментов Кисс и Уолл работали с Райаном Тапперо, руководителем направления рентгеновской флуоресцентной микроскопии (XFM), где Чиа и ее коллеги проводили дополнительные эксперименты для подтверждения своих выводов. На луче XFM ученые Корнелла хотели визуализировать внутреннее распределение элементов по сосудистой сети эмбриональных растений, которые содержатся в зрелых семенах. Хотя разрезать семена и сканировать их поверхность — подобно тому, как ученые изучали черешок листа с помощью C-XRF — было заманчиво, разрезание семян могло вызвать перераспределение элементов. Воздействие кислорода на хрупкие структуры также может привести к химическим реакциям, которые изменят их элементный состав. «Подобно тому, как врачи делают компьютерную томографию вашего тела, не разрезая вас, мы использовали рентгеновские лучи на луче XFM, чтобы провести «химическую» компьютерную томографию минеральных элементов внутри семян, не разрезая их», — объяснил Тапперо.
|
|
|
|
Медицинская компьютерная томография предполагает использование вращающегося источника рентгеновского излучения и детектора для выполнения серии снимков, на основе которых компьютеры могут реконструировать изображения поперечного сечения внутренних структур. Ученые NSLS-II не вращают рентгеновский луч, поэтому вместо этого они запрограммировали приборы для вращения образцов семян в рентгеновском луче во время записи сигналов рентгеновской флуоресценции. «Семена были всего полмиллиметра в диаметре, что делало их идеальными для сканирования в целости и сохранности», — объяснил Тапперо. Когда каждое семя яйцеобразной формы подвергалось воздействию сверхярких рентгеновских лучей, сигналы флуоресценции могли исходить из центра семян и измеряться кремниевым дрейфовым детектором. После первого воздействия приборы повернули образец менее чем на один градус, чтобы его можно было снова ударить под другим углом. Приборы автоматически повторяли этот процесс до тех пор, пока образец не был повернут на полные 360 градусов. Этот метод называется рентгенофлуоресцентной компьютерной микротомографией (F-CMT).
|
|
|
|
Изображения поперечного сечения F-CMT получаются на основе сигналов флуоресценции, как и обычные рентгеновские изображения; однако ученые используют дополнительные методы компьютерной реконструкции, чтобы получить изображения поперечного сечения. Используя эти изображения поперечного сечения для визуализации внутреннего распределения элементов в эмбриональных растениях, ученые наблюдали более низкие концентрации железа и меди в сосудистых клетках мутантных семян по сравнению с неизмененными семенами. Эти результаты послужили дополнительным доказательством того, что транспортер OPT3 перемещает как железо, так и медь. «Мы привезли наши образцы в NSLS-II, чтобы мы могли наблюдать за физиологией этого транспортного белка, и нам пришлось вернуться в нашу лабораторию с важной частью головоломки, которая лежит в центре всего этого», — отметил Чиа. «Все должно было сойтись воедино».
|
|
Еще одна глава в истории OPT3
|
|
|
|
Исследователи вернулись в свои лаборатории в Корнелле, чтобы осмыслить свои новые открытия, глубоко погрузившись в генетику мутантного растения. В ходе серии экспериментов они обнаружили, что железо и медь не только имеют общий транспортный белок, но также взаимодействуют в сложном сигнальном пути, который регулирует их поглощение посредством экспрессии генов. Это исследование является лишь одним шагом на пути к смягчению дефицита минералов у человека путем изменения содержания питательных веществ в съедобных растениях. Ватаманюк и ее коллеги изучили A. thaliana, нетравяное растение, которое часто используется в исследованиях, поскольку оно быстро размножается и имеет короткий геном, который полностью картирован. Теперь исследователи могут использовать свои результаты, чтобы изучить функцию этого транспортного белка в травяных растениях, таких как рис, пшеница или ячмень. «Физиология растения может настроить функцию транспортера», — объяснил Ватаманюк. «Поэтому важно применить эти знания к другим растениям. Я уверен, что нас ждут еще открытия». "Хочу выразить благодарность ученым NSLS-II, потому что они нам действительно помогают", - добавила она. «Характер сотрудничества очень важен, но они также очень дружелюбны и полезны». «У нас так много амбициозных идей, — сказал Чиа, — и они помогают нам воплотить их в жизнь».
|
|
|
|
Источник
|
