Сотрудничество между исследователями из Лаборатории медицинских наук (LMS) в Лондоне и Лаборатории молекулярной биологии (LMB) в Кембридже позволило раскрыть тайну, которая существовала десятилетиями, и которая может проложить путь к более эффективному лечению рака в будущем.
Работа, которая раскрыла основной механизм того, как одна из наших самых важных систем репарации ДНК распознает повреждения ДНК и инициирует их восстановление, ускользала от исследователей в течение многих лет. Используя передовые методы визуализации для визуализации того, как эти белки репарации ДНК перемещаются по отдельной молекуле ДНК, и электронную микроскопию для определения того, как они "привязываются" к определенным структурам ДНК, это исследование открывает путь к более эффективным методам лечения рака.
Сотрудничество между лабораториями профессора Дэвида Руэды (LMS) и доктора Лори Пассмор (LMB) стало блестящим примером того, как #teamscience может приносить плодотворные результаты, и подчеркивает важность этих двух институтов в продвижении исследований, которые раскрывают фундаментальные механизмы биологии, которые будут лежать в основе будущих переводов этой работы. в улучшение здоровья человека.
Исследователи работали над механизмом восстановления ДНК, известным как механизм анемии Фанкони (FA), который был выявлен более 20 лет назад.
На протяжении всей нашей жизни ДНК постоянно повреждается под воздействием факторов окружающей среды, включая ультрафиолетовое излучение солнца, употребление алкоголя, курение, загрязнение окружающей среды и воздействие химических веществ. Одним из способов повреждения ДНК является ее "перекрестное сшивание", которое лишает ее возможности нормально реплицироваться и экспрессировать гены.
Чтобы реплицироваться, а также считывать и экспрессировать гены, две нити двойной спирали ДНК сначала должны разделиться на отдельные нити. Когда ДНК сшивается, "нуклеотиды" ("ступени" лестницы двойной спирали ДНК) двух нитей склеиваются вместе, предотвращая это расцепление.
Накопление повреждений ДНК, включая перекрестные связи, может привести к раку. Путь FA активен на протяжении всей нашей жизни, он выявляет эти повреждения и постоянно их устраняет.
Люди, у которых есть мутации, которые делают этот путь менее эффективным, гораздо более подвержены раку. Хотя белки, участвующие в синтезе FA, были открыты некоторое время назад, оставалось загадкой, как они идентифицируют сшитую ДНК и запускают процесс репарации ДНК.
Команда из института-партнера MRC LMS, LMB в Кембридже, возглавляемая Лори Пассмор, ранее установила, что белковый комплекс FANCD2-FANCI (D2-I), который участвует в одном из первых этапов синтеза FA, прикрепляется к ДНК, тем самым инициируя репарацию ДНК при сшивании.
Однако оставались нерешенными ключевые вопросы: как D2-I распознает сшитую ДНК и почему комплекс D2-I также участвует в других типах повреждений ДНК?
В исследовании, опубликованном в журнале Nature, использовалась комбинация передовых научных методов, чтобы показать, что комплекс D2-I скользит вдоль двухцепочечной ДНК, контролируя ее целостность, а также было изящно визуализировано, как он распознает, где остановиться, позволяя белкам перемещаться и сцепляться в этой точке, чтобы инициируйте восстановление ДНК.
Артур Качмарчик (Artur Kaczmarczyk) и Корак Рэй (Korak Ray) из группы Дэвида Руэды (David Rueda), работающие с Пабло Альконом (Pablo Alcon) из группы Лори Пассмор (Lori Passmore), использовали современную технику микроскопии, известную как "коррелированный оптический пинцет и флуоресцентная визуализация", чтобы исследовать, как комплекс D2-I скользит по двухцепочечной ДНК молекула.
Используя оптический пинцет, они смогли уловить одну молекулу ДНК между двумя шариками, что позволило им точно манипулировать ДНК и инкубировать ее с выбранными белками.
Используя флуоресцентно меченый D2-I и одномолекулярную визуализацию, они наблюдали, как отдельные комплексы D2-I связываются с ДНК и скользят вдоль нее, сканируя двойную спираль. Они обнаружили, что вместо того, чтобы распознавать перекрестную связь между двумя нитями ДНК напрямую, зажим FA прекращает скольжение, когда достигает разрыва в одноцепочечной ДНК - области, где отсутствует одна из двух нитей ДНК.
Используя криоэлектронную микроскопию, мощный метод, позволяющий визуализировать белки на молекулярном уровне, исследователи затем определили структуру комплекса D2-I как в его скользящем положении, так и в месте соединения одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.
Это показало, что контакты, которые D2-I устанавливает с этим соединением одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, отличаются от контактов, которые он устанавливает только с двухцепочечной ДНК.
Это позволило им идентифицировать определенную часть белка FANCD2, называемую "спиралью KR", которая, как они показали в своих экспериментах по визуализации одиночных молекул, имеет решающее значение для распознавания и устранения пробелов в одноцепочечной ДНК.
Работая с Гийомом Гильбо и Джулианом Сейлом из подразделения PNAC LMB, а также с Темосом Лиолиосом и Паком Книпшером из Института Хубрехта, Нидерланды, они также показали, что способность комплекса D2-I задерживаться в этих соединениях с помощью спирали KR имеет решающее значение для репарации ДНК по пути FA.
Когда ДНК в норме реплицируется в наших клетках, она разделяет две цепочки ДНК и копирует каждую по отдельности. Это создает "репликационную вилку", при которой исходные цепочки ДНК разматываются и на каждой нити образуется новая двухцепочечная ДНК. Однако, когда эта вилка достигает перекрестной связи ДНК, нити не могут быть распакованы, что останавливает обычный процесс репликации ДНК.
Таким образом, эта остановленная репликационная вилка содержит открытые одноцепочечные промежутки, где ДНК была размотана, но не реплицировалась. Это исследование показало, что именно к этим соединениям между одноцепочечной и двухцепочечной ДНК на остановленной репликационной вилке плотно прикрепляется белковый комплекс D2-I.
Это не только позволяет комплексу D2-I доставлять другие белки FA-пути к сшивке ДНК, чтобы инициировать репарацию, но и закрепляет оставшуюся двухцепочечную ДНК, защищая остановленную "репликационную вилку" от ферментов в клетке, которые могли бы перегрызть открытый конец нити ДНК и привести к дальнейшему повреждению ДНК.
Эта работа показала, что именно структуры ДНК внутри репликационной вилки останавливаются в результате сшивания ДНК, а не сама сшитая ДНК, что заставляет комплекс D2-I прекратить скольжение и закрепиться на ДНК, чтобы инициировать репарацию. Эти застопорившиеся репликационные вилки появляются при многих типах повреждений ДНК, что объясняет широкую роль комплекса D2-I в других формах репарации ДНК, а также по пути FA.
Понимание процесса репарации ДНК и, что немаловажно, причин его сбоя имеет огромное значение, поскольку повреждение ДНК является ключевым фактором при многих заболеваниях. Важно отметить, что многие противораковые препараты, например цисплатин, вызывают настолько серьезные повреждения раковых клеток, что они перестают делиться и погибают.
В таких случаях пути восстановления ДНК — такой жизненно важный физиологический процесс в нормальной жизни — могут быть захвачены раковыми клетками, которые используют их, чтобы противостоять воздействию химиотерапевтических препаратов. Понимание механистической основы первого этапа репарации ДНК может привести к разработке способов повышения чувствительности пациентов, с тем чтобы в будущем лекарства от рака были более эффективными.
