23.01.2003. - Страсти вокруг ДНК

Страсти вокруг ДНК

Наталья Швецова

Ныне генетика интересна всем. И не случайно идут разговоры, что в XXI веке неизбежно произойдет смена лидера в естествознании: на место физики встанет генетика. Сложно сказать, будет ли так на самом деле, но одно можно утверждать точно: среди биологических дисциплин генетика сохранит свое ведущее положение.

1. Генетический штрих-код для каждой особи: генетика как подспорье систематики и других смежных дисциплин

Как известно, за передачу информации в человеческом, да и в любом другом живом организме отвечают молекулы ДНК, которые представляют из себя очень длинную цепочку из множества звеньев — так называемых нуклеотидных остатков четырех разных типов: аденина, тимина, гуанина и цитозина. Чередуясь между собой, они как бы создают определенный код, понятный для живых клеток. В нем зашифрованы инструкции, что и в какой последовательности делать клетке, чтобы не нарушался процесс жизнедеятельности организма. Многие из этих инструкций ученым удалось разгадать.

Однако, кроме осмысленных и понятных текстов — генов, в цепочке ДНК присутствуют целые участки, не несущие для клетки никакой полезной информации. Зачем нужны клетке эти «бессмысленные» участки ДНК, ученые пока не выяснили, хотя априори ясно, что ничего лишнего в природе нет. Но именно на этих «бессмысленных» участках ДНК находятся молекулярно-генетические зонды, по которым можно практически со стопроцентной точностью (одна «ошибка» на 300 миллиардов случаев) идентифицировать личность. Зонды устроены замечательно просто — это одна и та же последовательность нуклеотидных остатков, которые «голова к хвосту» много раз повторены. Число таких повторов для каждого человека строго индивидуально.

Уже известно, что геномы человека и одного из его ближайших «родственников» — шимпанзе, совпадают на 99 процентов. Где проходит «граница», ученые сегодня не знают, поэтому получают сведения об индивидуальных особенностях личности, анализируя группы характерных участков ДНК, рассредоточенных по всему геному.

Чтобы было понятно, это сравнимо с тем, если бы в одной из нескольких книг с неизвестной вам письменностью надо было отыскать страницу, которую вы однажды запомнили. Вы бы вначале отсортировали тома, и по размеру, объему, цвету переплета нашли нужную книгу. Потом, сверяясь с памятью, стали бы анализировать страницы: количество абзацев, их высота, число слов в последней строке и так далее… Пользуясь нынешней методикой и специальной аппаратурой, ученые безошибочно выходят на нужные «страницы», причем даже в тех случаях, когда их надо отыскать в практически неразличимых экземплярах одного «тиража». Расшифровка полной нуклеотидной последовательности всей ДНК человека может совершенно изменить характер исследований в области идентификации. Объектом изучения экспертов, видимо, станет в основном «человеческая» часть генома, и они будут точно знать, где в ней следует искать ответ на нужный вопрос. То есть, если продолжить наше сравнение, произойдет вот что: вы освоите неизвестную письменность, узнаете, как обозначаются в ней цифры, и, чтобы найти искомое, вам достаточно будет запомнить название книги и номер страницы. Это, очевидно, уже совершенно иной порог знаний и возможностей.

Выше речь шла об идентификации генетического материала человека. Однако очевидно, что спектр применения генетики гораздо шире. Во втором разделе этой статьи будут подробнее описаны, например, способы применения генной инженерии и вопросы клонирования; здесь же остановимся на интереснейшем проекте канадских таксономов, ученых, занимающихся систематизацией животного и растительного мира Земли.

На протяжении многих тысячелетий человечество пыталось классифицировать все живое — и сейчас систематизировано лишь 10% от всего разнообразия видов. До сих пор таксономия была по большей части наукой наблюдения — если безымянная птица выглядит как утка, и крякает как утка — значит, это утка. Но изучение миллионов видов показало, что визуально-поведенческий подход неверен, и уткоподобная крякающая птица вполне может оказаться, например, гусем.

А есть ещё живые организмы, которые и вовсе невозможно классифицировать при использовании стандартных таксонометрических методов — например, бактерии и вирусы. Именно столкнувшись с проблемой классификации микромира, ученые из канадского University of Guelph задумались о возможности создания уникального биологического «штрих-кода» для каждой особи на основе особенностей строения ее ДНК.

Генетический код построен на основе четверичной системы — из уже упоминавшихся нуклеотидных остатков: аденина, тимина, гуанина и цитозина. Но поскольку цепочка ДНК может состоять из миллионов повторений этого квартета, генетическое разнообразие живого — огромно. Достаточно представить, что теоретически требуется всего 15 нуклеотидных остатков (повторяющихся некоторое количество раз) для того, чтобы составить миллиард уникальных цепочек.

На практике, однако, все несколько сложнее: кирпичики, составляющие ДНК, расположены не случайным образом, поэтому далеко не каждая из миллиарда возможных цепочек будет «рабочей». До недавнего времени задача составления генетических карт, или, точнее, схем — не показывающих полный рисунок цепочки ДНК, но содержащих достаточную для идентификации особи информацию — считалась весьма сложной и трудоемкой. Ещё несколько лет назад у ученых были проблемы с выделением из образца ткани необходимой цепочки. Теперь же путь от хитина на лапке жука до его ДНК может быть пройден всего за несколько часов. Ускорить процесс распознавания нужных участков дезоксирибонуклеиновой кислоты помогла закономерность, которая ранее не была замечена учеными: вместо того, чтобы выделять геном из ядра клетки, можно выделить меньшую цепочку из митохондрии — одного из компонентов клетки. Такая цепочка практически не будет содержать «пассивных» участков, описанных выше, наличие которых существенно замедляют процесс идентификации ДНК.

Именно в цепочках, выделенных из митохондрий, ученым удалось определить ряд генов, комплект которых можно использовать как универсальный идентификатор, уникальный биологический штрих-код. Особенно привлек внимание ген, отвечающий за производство энергии в клетке — его сравнительно легко изолировать и использовать как генетическую «метку», по которой можно не только одну особь отличить от другой, но и с высокой степенью точности (фактически, самой высокой из всех возможных) соотнести виды, установить степень их родства.

Как видно, генетика устроила настоящую революцию в таксономии. Очевидно, уже через несколько лет материал для исследований таксономов будет представлен обширными библиотеками генетических штрих-кодов. А большая часть работы, которой заняты современные систематики, будет выполняться специальными компьютерными системами. И все это благодаря генетике.

2. Клонирование — триумф генетики или профанация?

По принятому в науке определению клонирование — точное воспроизведение того или иного живого объекта в каком-то количестве копий. Вполне естественно, что все эти копии должны обладать одинаковой наследственной информацией, то есть нести набор генов, идентичных генам «родителя», в отличие от существ, возникших путем естественного размножения, при котором генетический материал двух родителей по-разному смешивается в каждой особи потомства. В ряде случаев получение клона животных не вызывает особого удивления и считается рутинной процедурой, хотя и не такой уж простой. Генетики добиваются этого, используя объекты, способные размножаться не только половым путем, но и посредством партеногенеза, то есть без предшествующего оплодотворения. Поскольку такой процесс контролируется генетически, возможно вывести линии, в которых размножение происходит только партеногенезом. Естественно, те особи, которые станут развиваться из потомков той или иной исходной половой клетки, в генетическом отношении будут одинаковыми и могут составить клон. У нас в стране, например, блестящие работы по клонированию такого рода выполняет на шелкопряде с помощью разработанной им специальной методики академик Владимир Александрович Струнников. В своих работах он, однако, отмечает, что клонированные особи не идентичны друг другу, но оказываются разнообразными по целому ряду так называемых количественных признаков — величине, продуктивности и плодовитости. В ряде клонов это разнообразие бывает большим, чем в обычных генетически разнообразных популяциях.

На этой основе можно заключить, что принципиальный ответ на вопросы «возможно ли клонирование живых организмов?» и «идентичны ли друг другу клонированные особи?» получены. На первый — ответ положительный, на второй, очевидно, отрицательный.

Обратимся к принципиальной схеме механизма клонирования. В эмбриологии, например, тоже известны методы получения клонов. Если зародыш морского ежа на стадии раннего дробления искусственно разделить на составляющие его клетки — бластомеры, то из каждого разовьется целый организм. В ходе последующего развития зародышевые клетки теряют эту способность и становятся все более и более специализированными. Можно также использовать ядра так называемых стволовых эмбриональных клеток от какого-нибудь конкретного раннего эмбриона, которые еще не являются очень специализированными (таковым будет их потомство). Эти ядра пересаживаются в яйцеклетки, из которых удалено собственное ядро, и такие яйцеклетки, развиваясь в новые организмы, опять-таки могут образовать клон генетически идентичных животных. У человека известны случаи своеобразного «естественного» клонирования — это так называемые однояйцовые близнецы, которые возникают благодаря редко встречающемуся естественному разделению оплодотворенной яйцеклетки на два отделяющихся друг от друга и в последующем самостоятельно развивающихся бластомера. Они очень похожи друг на друга, но все же не идентичны.

Однако сейчас речь идет о другого рода клонировании, а именно о получении методом пересаживания ядра соматической клетки взрослого индивида в яйцеклетку, из которой ее собственное ядро предварительно удалено, ряда точных копий того или иного взрослого животного. При этом животного, «прославившегося» какими-то своими выдающимися качествами (например, рекордные надои молока, высокий настриг шерсти и т. д.), а, возможно, ученого, политика или артиста, особо ценного для человечества в силу его определенных качеств. Вот тут-то и возникают весьма и весьма большие сложности, в которых предстоит разобраться.

Обратимся к истории генетики и первым опытам по клонированию живых организмов, ставших известными широкой публике.

Все началось с опытов российского эмбриолога Г. В. Лопашова, который ещё в 40-х гг разработал метод пересадки (трансплантации) ядер в яйцеклетку лягушки. Но огласки опыты не получили (в то время советская биология была подвластна печально известному Трофиму Лысенко), и только десятилетие спустя американские и английские биологи начали выполнять опыты на основе работ Лопашова. Они добились развития яйцеклеток с чужим ядром до достаточно поздних стадий. И вот 1 — 2 процента особей проходили стадию метаморфоза и превращались во взрослых лягушек. Впрочем, такие лягушки оказывались не без дефектов, да и выглядели более хилыми по сравнению со своим «родителем» (донором ядра), так что даже в этом случае едва ли можно говорить об абсолютно точном копировании.

Тогда и заговорили о клонировании млекопитающих и человека: если можно клонировать лягушку, почему бы не попробовать то же самое на других объектах. Первый форум, на котором всерьез рассматривалась проблема клонирования животных, был Международный генетический конгресс в Беркли (США) в августе 1973 года.

Примерно в то же время была опубликована статья Карла Иллмензее, из которой следовало, что ему удалось получить клон из трех мышек. После создания авторитетной комиссии на работе Иллмензее был поставлен крест: ее признали недостоверной. Таким образом, по самой проблеме был нанесен весьма болезненный удар, оказалась под сомнением ее разрешимость. Внимание к клонированию, таким образом, ослабло на некоторое время. Но не так давно появилось сообщение о рождении овечки Долли, что вызвало небывалый интерес к этому вопросу. Только тогда мало кто обратил внимание на то, что в экспериментах Яна Вильмута, «автора» Долли, процент выхода рожденных животных оказался ничтожно мал — всего одна овечка из 236 попыток. А что с остальными? Развивались уродами и погибали? И где же, собственно, клон, предполагающий множество копий? Следом за сообщением Вильмута в одном из январских номеров «Science» появилось сообщение д-ра Витторио Сгарамелла из Университета Калабрия (Италия) и д-ра Нортона Зайндера из Рокфеллеровского университета (США), в котором авторы считали, что не представлено убедительных доказательств того, что Долли — продукт клонирования. Кроме всего прочего, оказалось, что три ведущих в данной области лаборатории пытались воспроизвести результаты опытов Вильмута, но безуспешно. Авторы этой статьи указывали и на возможный источник ошибки шотландских эмбриологов. Дело в том, что овца, у которой брали соматические клетки для Долли, была беременна. А известно, что фетальные клетки (клетки зародыша) у некоторых животных могут попасть в систему циркуляции (кровоток). Вильмут признал, что совершенно упустил из виду это обстоятельство, и не исключил возможности такого рода просчета в своих экспериментах. Но недавно точными молекулярно-генетическими исследованиями было доказано, что Долли — клонированная овечка и, следовательно, выдвинутые возражения можно считать снятыми.

Однако очевидно, что многочисленные сообщения о получении клонов человека или о том, что где-то бродят стада клонированных коров, либо ошибочны, либо это сознательная мистификация. Для аргументации этого утверждения необходимо рассказать о некоторых деталях процесса клонирования.

Конечно, получение клонированной овечки — существенное научное достижение, из которого можно сделать важнейшие заключения о глубине изменения клеточных ядер в процессе дифференциации клеток. Дело в том, что в ходе индивидуального развития организма в ядрах клеток различного типа происходит ряд изменений: одни гены активно работают, другие — инактивируются и молчат. И чем более специализирован организм, чем выше ступенька эволюционной лестницы, на которой он стоит, тем эти изменения глубже и тем труднее обратимы. У некоторых организмов, например, у известного кишечного паразита аскариды, генетический материал в будущих зародышевых клетках остается неизменным в ходе развития, а в других, соматических, клетках из хромосом выбрасываются большие фрагменты ДНК — носителя наследственной информации (в подобных случаях ни о каком клонировании, естественно, не может быть и речи). В красных кровяных шариках (эритроцитах крови) птиц ядра «сморщиваются» в маленький комочек и не «работают», а потому из эритроцитов млекопитающих, стоящих эволюционно выше птиц, вообще выбрасываются за ненадобностью. У плодовой мушки дрозофилы эти процессы — селективное умножение или, наоборот, недостача каких-то участков ДНК, по-разному проявляющиеся в разных тканях, — выражены особенно четко. Уже упоминавшийся Карл Иллмензее выполнил блестящее исследование по трансплантации «зрелых» ядер, выделенных из клеток дрозофилы, в развивающуюся яйцеклетку этого насекомого для того, чтобы выяснить их способность обеспечивать развитие мухи. Оказалось, что в этом случае эмбрионы развиваются только до определенных стадий и с отклонениями от нормы, то есть с появлением уродств. Следовательно, в ходе развития в «зрелых» ядрах дрозофилы происходят необратимые изменения и они теряют способность давать начало целому нормальному организму.

Кроме того, сейчас много говорится еще об одной работе, в которой показано, что в соматических клетках в ходе их развития хромосомы последовательно укорачиваются на своих концах, в зародышевых же клетках специальный белок теломераза достраивает, восстанавливает их, то есть полученные данные опять-таки свидетельствуют о различиях между зародышевыми и соматическими клетками.

Если даже у лягушки — существа менее развитого и, соответственно, с менее четко выраженными ядерными изменениями — и то процент успеха при клонировании, как уже упоминалось, весьма низок, то в случае млекопитающих сложности многократно возрастают. Успех будет зависеть от того, удастся ли среди множества клеток «выхватить» такую очень редко встречаемую, у которой ядро еще не утратило свой потенциал. Либо же решать проблему, как возвратить изменившиеся ядра соматических клеток в исходное состояние.

Не случайно сегодня особый интерес вызывают опыты группы ученых из университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторы сумели усовершенствовать метод Вильмута: они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью которой удалось «безболезненно» трансплантировать ядро (опыты проводились на мышах). Кроме того, они использовали в качестве донорских ядра клеток, окружающих яйцеклетку. Процент «выхода» рожденных мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения) был в разных сериях от 2 до 2,8. Молекулярные исследования, как и в случае с Долли, подтвердили: мышата — продукт клонирования. Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.

Но и эти результаты еще не позволяют всерьез говорить о клонировании, а тем более — о «копировании» человека. Действительно, допустим, что трансплантировали развивающиеся яйцеклетки с чужеродными ядрами нескольким сотням (если не тысячам) приемных матерей (процент выхода-то низкий, и, скорее всего, его не удастся существенно повысить), чтобы получить хотя бы единственную (тут уж не до клона) рожденную живую копию человека. Но что будет с остальными зародышами? Ведь большая часть их погибнет в утробе матери или разовьется в уродов, часть которых, не дай Бог, родится. Конечно, это было бы не только аморально, но и преступно, а потому вполне естественно ожидать принятия закона, запрещающего подобные эксперименты.

Кроме всего прочего, в генетике есть такое понятие, как норма реакции. Это степень вариативности в проявлении признака, контролируемого тем или иным геном. Например, существует ген пегости, от которого зависит пятнистая окраска животного. И этот (один и тот же) ген у разных животных может вызвать как образование, например, отдельных единичных темных пятен на светлом фоне, так и почти полное «потемнение» тела. Степень «потемнения» зависит от влияния многих других генов (каждый из которых имеет свою норму реакции), от воздействия внутренней (которая у разных приемных матерей будет разной) и внешней среды (температура, влажность, содержание кислорода и всяких других веществ в воздухе, уровень радиации и прочее). Спрашивается, велика ли вероятность точного воспроизведения свойств «клонируемого» образца?

Вообще же, если речь идет о млекопитающих, такого рода опыты целесообразно продолжать, но на мышах, крысах и кроликах. Стоить они будут много дешевле, чем, скажем, опыты на коровах, а результат — тот же самый: ответ на принципиальный вопрос о характере изменений ядер в ходе индивидуального развития чрезвычайно важен для становления генетики. Большие же деньги, требуемые для работ по клонированию сельскохозяйственных животных, лучше использовать для поддержки исследований по получению трансгенных животных, содержащих полезную чужеродную информацию (например, коров или коз, способных вместе с молоком продуцировать полезные лекарственные вещества вроде инсулина), генотерапии (лечения путем искусственного введения нормальных генов, исправляющих дефекты в обмене веществ), геному человека, генной инженерии.

Безусловно, есть потребность в разработке определенного кодекса биологической и медицинской этики, который исключал бы проявления неоправданной жестокости при постановке биологических или медицинских экспериментов. Составлять его должны ведущие специалисты в этой области и знающие предмет юристы, иначе появится нечто подобное проекту закона о биоэтике, представленному в Государственную Думу, — среди его составителей никому не известные врачи и юристы да двое православных священников, по-видимому, не очень сведущих в биологии. В проекте предлагается практически полностью запретить работы по трансплантации тканей, что поставит под угрозу уничтожения целую важную и эффективно работающую отрасль медицины — трансплантологию. Не проконсультированы со специалистами и части проекта, касающиеся ограничений в области генной инженерии и генотерапии. Спорен вопрос о запрете абортов, если они делаются без медицинских на то показаний. Не случайно представленный в Думу проект был критически воспринят научной общественностью, включая крупнейших специалистов в сфере медицинской генетики — академиков Российской академии медицинских наук В. И. Иванова и Н. П. Бочкова.

У генетики множество аспектов, имеющих выход в социальную, политическую и этическую сферы. Например, вопрос об использовании достижений этой науки в целях улучшения человеческой «породы». Всерьез задумывались об этом нацистские руководители и преданные им представители биологии в Германии в 30-е годы, усиленно разрабатывавшие расовую теорию. Однако подобные идеи, которым несправедливо присвоили название «евгеника», были чужды мировому генетическому сообществу, воспитанному в гуманистическом и демократическом духе.

В свое время в Советском Союзе проводилась политика, направленная на «придерживание» развития такого важного раздела генетики, как генетика поведения. Человека полагалось считать плодом чистого воспитания, с помощью которого можно лепить любую «продукцию» из исходного, абсолютно одинакового, ничем не различающегося человеческого «материала» (именно так трактовалось понятие «равенство»). А генетики утверждали, что многие не только физические, но и психические качества определены генетически и лишь частично поддаются влиянию среды и внешней коррекции. Изучение генетики поведения совершенно необходимо, это позволяет понять механизмы патологических отклонений (в том числе и преступности) в поведении человека, выявить способности к тем или иным видам творческой деятельности. Достаточно вспомнить, сколь жестоко поступали в нашей стране с гомосексуалистами, объявляя их врагами коммунистической морали, продуктами разложения общества, инспирированного агентами мирового империализма. Но оказалось, что случаи гомосексуализма обнаруживаются у представителей самых разных видов животных, даже у насекомых. Более того, американские генетики доказали, что у дрозофилы этот признак наследуется, нашли и локализовали определяющий его ген, который затем выделили и изучили тонкое строение последнего. Недавно в лаборатории известного нейрогенетика Дэна Хамера из Института национального здоровья в Бетезде (США) нашли этот ген и у человека, он локализован в половой Х-хромосоме. Бесспорно, это открытие генетиков социально и юридически значимо. Оно с очевидностью заставит по-новому взглянуть на некоторые формы поведения, которые расценивали как извращение, вызванное порочным воспитанием, или как болезнь. В связи с этим придется также пересмотреть и некоторые общепринятые нормы морального кодекса.

Следует также отметить вопрос взаимосвязи наследственности, мутаций и национального характера. Ясно, что морфологические изменения связаны с генами, с наследственностью. Но влияют ли гены на изменения в культурах? И наоборот, оказывает ли культура того или иного сообщества какое-либо влияние на гены входящих в данное сообщество людей?

Культурные особенности этнической группы отражают ее историю и условия обитания. Есть несколько параметров, по которым описывают психологические особенности различных этнических групп: коллективизм/индивидуализм, феминность/маскулинность, консерватизм/восприимчивость к инновациям. Что влияет на формирование этих особенностей? Насколько они устойчивы? Связаны ли они с генами? Например, показано, что разные варианты гена рецептора дофамина (родственного ему рецептора DRD4) влияют на стремление человека к получению новых впечатлений и склонность к риску. «Авантюрный» вариант гена чаще всего встречается у коренного населения Америки (48%), а реже всего — у жителей Южной и Восточной Азии (менее 2%). Хотя, конечно, гены не определяют наборы ценностей, установок, верований, норм и моделей поведения, которыми различаются культуры, вероятно, некоторые генетические особенности могут давать вклад в национальный характер.

Некоторые мутации могут быть связаны с образом жизни. Например, удвоение генов цитохрома Р450 у народов Саудовской Аравии — у них около трети населения имеет такие дупликации, тогда как у других народов они встречаются с частотой лишь 1–2 %. Связывают это с особенностями диеты — предположительно, с усиленным потреблением красного перца.

Современная генетика вряд ли сможет дать однозначный ответ на вопрос «очевидна ли связь генотипа и культуры?», однако уже сейчас весьма широко используются данные генетики в исследованиях по кросс-культурной психологии. Некоторые генетические особенности могут оказаться важными для выживания этнической группы. Наиболее известна, наверное, мутация, связанная с пониженной восприимчивостью к ВИЧ. Ее частота в различных группах колеблется от 0 до 18–20 %. В рамках всемирной программы «Геном человека» есть направление Human Genome Diversity — изучение разнообразия генома человека.

Несомненно, сейчас генетика является одним из лидеров в естествознании, среди биологических дисциплин она с каждым годом исследований укрепляет свое положение. Здесь, очевидно, имеется политическая подоплека: хорошо известны, например, значительные финансовые вливания в те отрасли генетики, которые приносят пользу сельскому хозяйству или медицине. Еще лучше известны запретительные меры, принимаемые не только в России, но и во всем мире. В СССР в свое время запретили генетику в целом, поскольку она стояла костью в горле господствующей идеологии, в Америке хотели запретить генную инженерию, испугавшись, как бы та не создала возбудителей новых страшных заразных болезней (как пример приводится небезызвестное заявление американского биохимика Поля Берга), в ряде стран разрабатываются проекты или принимаются решения о запрете экспериментов по клонированию человека, что, по всей вероятности, справедливо.

Вызывает некоторые опасения и то, что клонирование сделалось весьма расхожей темой, привлекающей внимание не только специалистов, но и широкой публики. Заявления псевдоученых делают научные опыты аттракционами, не имеющими, при этом, ни общественной, ни научной ценности. Кроме того, активное муссирование темы в прессе способствует формированию ошибочных взглядов общества на клонирование в частности и генетику в целом. Искажается представление о предназначении генетики вообще. Нагнетается в известной степени отрицательный имидж, люди начинают испытывать страх перед потенциальной властью, которой обладает генетика.

Страх сжечь свое поселение не помешал первобытному человеку развести огонь — и огонь подтолкнул эволюцию; страх уничтожить все живое на планете не помешал разработкам в области атомной энергии — и атомная энергия стала техническим прорывом; теперь же — страх возможных необратимых для человечества последствий, будем надеяться, не помешает развитию генетики, и генетика послужит человечеству добром.

Источник:CNews.ru 20.01.2003